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一、標本的采集與處理

（一）標本的采集

1、病毒分離標本的采集

病毒分離成功與否很大程度上取決于采集標本的質(zhì)量，及其保存、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)。多數(shù)標本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次為氣管和支氣管分泌物，有時也采用肺活檢材料等。

標本采集后應立即放入適當?shù)牟蓸右褐械蜏乇４妫Ｓ玫牟蓸右簽椋浩胀ㄈ鉁琾H7.4-7.6的Hank‘s、Eagle’s或水解乳蛋白液。為防止細菌和真菌生長，在采樣液中需加入抗菌素，以往抗菌素多用青、鏈霉素，近來發(fā)現(xiàn)不少種類細菌對它們具有耐藥性，故近來多用慶大霉素（其終濃度為每ml采樣液中加入0.1 ml的10mg/ml）和抗真菌藥物（終濃度為每毫升采樣液中加入0.008 ml的250ug/ ml）。主要的采集方法有以下幾種：

1）鼻拭子：將棉簽輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動退出。以同一拭子拭兩側(cè)鼻孔。將棉簽浸入4-5 ml采樣液中，尾部棄去。

2）咽拭子：用棉簽擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，同樣將棉簽頭浸入4-5 ml采樣液中，尾部棄去。注：亦可將鼻、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高分離率，減少工作量。

3）鼻咽抽取物：用與負壓泵相連的收集器（國外有售）從鼻咽部抽取粘液。先將收集器頭部插入鼻腔，接通負壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器3次。由于該收集器國內(nèi)難買到，也可采用國內(nèi)一種設計裝置（見郭元吉、程小雯著，流行性感冒病毒及其實驗技術。中國三峽出版社P186，1997）。

4）鼻洗液：患者取坐姿，頭微后仰，用移液管將1-1.5ml洗液注入一側(cè)鼻孔，囑患者同時發(fā)K音以關閉咽腔。然后讓患者低頭使洗液流出，用平皿或燒杯收集洗液。重復此過程數(shù)次。洗兩側(cè)鼻孔zui多可用10-15 ml洗液。

5）漱口液：用10 ml洗液漱口。漱時讓患者頭部微后仰，發(fā)“噢聲”，讓洗液在咽部轉(zhuǎn)動。然后，用平皿或燒杯收集洗液。

注：取鼻洗液和漱口液時，需預先了解患者是否對抗菌素有過敏史，如有則洗液和含漱液中不應含有抗菌素。

2、血清標本采集

血清標本應包括急性期和恢復期雙份血清。急性期血樣應盡早采集，zui遲不超過發(fā)病后7天。恢復期血樣應在發(fā)病后2-4周采集。單份血清一般不能用作診斷。血液標本2000-2500rpm離心15min。收集血清，棄血凝塊。血清可在4℃存放一周，長期保存置-20℃。

（二）標本運送

標本應在低溫下，24小時內(nèi)運送至實驗室。標本至實驗室后，病毒分離標本應盡快進行接種分離，48h內(nèi)能進行接種的可置于4℃保存，如未能接種應置-70℃或以下保存。     血清標本可在4℃存放一周，長期保存置-20℃或以下。

（三）標本處理

標本至實驗室后，含棉拭子的標本，先將棉拭子在管壁反復擠壓后取出。鼻腔或咽部洗液，用手將裝標本的管充分振蕩，將粘液打碎。置4℃待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接種或低溫保存。

鼻咽漱液或抽取液：用無菌毛細吸管，在無菌條件下反復吹打收集的溶液，以便打碎粘液，同樣置4℃待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接種或低溫保存。

注：如采樣液中尚未加抗菌素，應在接種前補加，用量同前，混勻后置4℃ 1-2h后方可接種。

二、病毒分離

病毒分離是流感診斷zui常用和zui可靠的方法之一。多用雞胚來分離流感病毒。近來隨著分子生物學技術的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)通過雞胚所分離到的流感病毒，其抗原性與原始標本的有所不同，而通過MDCK細胞分離出的，其抗原性與原始標本的相似。另外由于“O”相毒株的重現(xiàn)，MDCK等一些細胞對“O”相毒株的敏感性大大超出雞胚的敏感性。因此，MDCK等一些細胞已成為流感病毒分離*的一種宿主系統(tǒng)。MDCK分離的病毒在很多國家尚未批準用于疫苗生產(chǎn)，因此在病毒分離時同時采用雞胚和MDCK細胞兩套系統(tǒng)。     流感病毒“O”相毒株不凝集雞紅細胞，故近來在流感病毒鑒定中常用豚鼠或人紅細胞來代替。然而，該兩種細胞無細胞核，沉積慢，一般在紅細胞凝集及凝集抑制測定中需60分鐘才能觀察結(jié)果，同時在“U”型孔板中，很難沉積成像眼淚樣的點即當中常有小空洞。

（一） MDCK細胞分離

1、實驗材料

MDCK細胞

Eagle氏培養(yǎng)液

Hank‘s溶液

0.25%胰酶和Versene消化液

雙抗（青、鏈霉素）或慶大霉素和抗真菌素

胎牛或小牛血清

5.6%或7.5%的NaHCO3

細胞培養(yǎng)液配制

每500 ml Eagle’s 液加： 終濃度

雙抗 5 ml 100U/ml青霉素

100ug/ml鏈霉素

胎牛或小牛血清 0.1-0.15ml/ml

使用前用NaHCO3 將pH調(diào)至7.4-7.6。

細胞維持液配制

同培養(yǎng)液，但不含胎牛或小牛血清，而含終濃度為2-3 ug/ ml 胰酶，用前用NaHCO3 將pH調(diào)至7.6-7.7。

注：目前市場上出售已配好的Eagle‘s試劑有兩種：一種已含有谷氨酰胺，另一種不含。如不含，配工作液時需補加。

2、病毒接種和收獲

1） 在低倍光學顯微鏡下檢查MDCK細胞生長狀態(tài)。

2） 成片的細胞棄生長液，用Hank’s液洗兩遍，將殘余的牛血清洗凈，因牛血清中含有流感病毒非特異性抑制素，會影響流感病毒的復制。

3） 每瓶加入接種標本0.5-1.0 ml，輕搖細胞瓶，使標本*覆蓋細胞，置35℃吸附1-2h。

4） 倒掉感染液，再用Hank‘s液洗1-2遍，每瓶加入3 ml維持液，置35℃培養(yǎng)。

5） 次日起每天檢查有無細胞病變（CPE）。CPE特征為：細胞腫脹圓化，細胞間隙增大，細胞核固縮或碎裂，嚴重時細胞部分或全部脫落。

6） 收獲及紅細胞凝集活性（HA）檢查

當CPE出現(xiàn)+++ ~ ++++號時進行收獲，收獲之前也可將細胞凍融1-2次來提高收獲標本的病毒滴度。由于無法證實CPE就是流感病毒所造成。zui后還得看維持液中是否有紅細胞凝集活性（HA）。用毛細吸管取維持液3-4滴，放入血凝板孔中，而后加入等容量的1%豚鼠或人紅細胞，輕搖混之，置室溫或4℃，1h后觀察結(jié)果。出現(xiàn)紅細胞凝集的為陽性標本，收獲所有維持液進行病毒鑒定，也可暫冰存之。有時將收獲的維持液，離心棄沉渣，上清中加適量無菌甘油或明膠或1%牛血清白蛋白凍存之。

由于維持液中無牛血清，同時含一定量的胰酶和NaHCO3，故不應在4℃保存，否則易造成HA活性丟失和pH變高。如有清晰的CPE，但HA陰性應進行盲傳。

注：維持液中加適量胰酶的目的是為了提高流感病毒在細胞中的復制能力。絕大多數(shù)流感病毒只有血凝素（H）是裂解型的才具有感染性。細胞培養(yǎng)不像雞胚，它的維持液中不含有蛋白水解酶，無法將病毒粒非裂解型的HA0 變成裂解型的HA1+HA2。故必須在維持液中加入適量的胰酶。CPE出現(xiàn)時間隨感染病毒的型別，甚至毒株的差異以及感染量的大小而異。一般標本接種后7天還不出CPE，維持液中又查不出HA活性，可認為陰性標本，棄之。

7）傳代及盲傳

如收獲的維持液HA滴度不高或量不夠用于鑒定，需在MDCK細胞或雞胚中傳代，把HA滴度提高或量增多。如HA可疑，細胞CPE清晰，此時應在MDCK細胞上盲傳一代，如仍測不出HA，可認為是陰性。如仍有清晰的CPE并能排除細菌所引起也可認為是非流感病毒。

3、MDCK細胞傳代

（1） 把需用的溶液置室溫或37℃水浴中預熱。

（2） 已成片的MDCK細胞，將其生長液倒掉。

（3） 把Versene與0.25%胰酶按7：1比例配成消化液，每小瓶加入消化液3 ml（加入量應根據(jù)瓶大小不同而異）。

（4） 置37℃恒溫箱5-10min，在此期間應在光學顯微鏡下觀察1-2次，當細胞變圓，細胞與細胞間互不相聯(lián)，表明消化時間已到。如細胞仍連成片，表明消化時間未到。但千萬不可消化時間過長，造成大量細胞從瓶壁上脫下，甚至造成破碎。

（5） 倒掉消化液，每瓶加入9 ml培養(yǎng)液，用毛細吸管將瓶壁上細胞輕輕吹下吹散。

吸出6 ml接種2小瓶，3 ml/瓶，將原瓶留下，置37℃恒溫箱培養(yǎng)。

（7） 一般情況下，1瓶細胞傳3瓶，如細胞急用，可一傳二。不急用，可一傳四等。有時為了控制細胞的代數(shù)，可一傳八，這樣一星期傳一代就可以了。一般情況每2-3天需傳一代。

4、MDCK細胞保存及復蘇

MDCK細胞對流感病毒的敏感性隨其代數(shù)增加而下降，故各實驗室應使用液氮凍存代數(shù)較低的細胞作為種子。一般保存液為含10%二甲基亞砜和90%小牛血清。

（1）MDCK細胞保存

將單層細胞消化分散成為單細胞；加入0.9 ml小牛血清和0.1 ml二甲基亞砜；相混收集于保存小管中；緩慢凍存：放4℃2h，轉(zhuǎn)放-20℃2h，再轉(zhuǎn)放液氮中長期保存，也可置-70℃短期保存。

（2）MDCK細胞復蘇

細胞凍存管從液氮罐取出后，速放37℃水浴溶化，溶化后加入3 ml培養(yǎng)液，混均后加入細胞培養(yǎng)瓶中，置37℃CO2孵箱培養(yǎng)。

（3）MDCK細胞對流感病毒敏感性測試

前面提到MDCK細胞對病毒的敏感性隨其代數(shù)增加而下降。故MDCK細胞在實驗室傳20代以上時，一般需測試一下其對流感病毒的敏感性。其具體測試方法：選一株對MDCK細胞較敏感的流感病毒株，為當前在人群中流行的甲型流感病毒。在同一條件下，用早代與要測試的MDCK細胞對其進行TCID50測定。如果測試的TCID50比早代的低2個或以上Lg，表明其對病毒的敏感性已下降，不應繼續(xù)使用；如果兩者相差不超出一個Lg，表明可繼續(xù)使用。